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基于捕获抗体偶联纳米纤维素膜的表面等离子共振与侧流免疫层析检测大麻毒素

发部时长:2023-11-15 16:16:04收入:抗体阳性典故

【引言】

大麻毒物的高灵敏度检查测量相对于工地快产前筛查非发治疗药物尤其最重要,大麻的主耍有效成分为(-)Δ9 -四氢大麻酚(THC)。本研究制备了通过N-(3-二甲氨基丙基)-N ' -乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联捕获抗体的硝酸纤维素膜(NC膜),以检测抗体-THC免疫复合物。TEMPO氧化的纳米纤维素(TOCNF)具备高体表面积比、OH基团丰富、高亲水性等优点。在表面等离子体共振(SPR)中观察到抗体牢固结合在NC膜上且保持了生物活性,检测范围为1-10 μg/mL。使用HRP标记的检测抗体作为检测抗体,通过比色法在纸基上实现了THC的定量检测,与依靠静电作用的物理吸附连接的界面相比,共价作用连接的界面检测效率更高。虽然抗体与未修饰的NC膜能够有效结合,但超分子吸附导致的捕获抗体与免疫复合物的结合率较低,因此,本研究开发的锚定捕获抗体的NC膜具有重要意义。

1. 百科

据联办国《2022年世纪大麻报告模板》称,大麻是世界各国运用最少的不法治疗药物,约占世界各国大麻生产量的就不。大麻的主耍的精神活性氧的成分是(-)Δ9 -四氢大麻酚(THC),与中枢神经系统中的受体结合可以引起欣快感,四氢大麻酚的代谢物11-甲基-9-羧基-9-四氢大麻酚(THC- COOH),也是常见的检测靶分子。随着即时检测需求的增加,唾液中靶标的检测也是十分必要的。为了开发高度准确、灵敏的检测方法,抗体或其他识别元件需要有效结合在检测界面上,而吸附的不良可能导致抗体丧失生物活性或与流动相中的样品分离。

NC膜常被用到LFAs的反馈膜,它够无可逆地组合核核苷酸,兼具很好的信噪比。工业NC膜常是疏水的,必须要外壁活力性剂展示 的资产流动性,但外壁活力性剂的来源于上限了采集抵抗能力阳性的组合。碳二酰亚胺热塑是用最广泛泛的偶联带异羧基或胺基有机化合物的办法,已经通讯报道顺利完成确认EDC/ NHS法将人抗免疫抗体性球核血清抵抗能力阳性偶联在TOCNF膜上,不仅另外羧甲基合成木质素(CMC)膜等。合成木质素兼具高生物学混溶性、低费用、低致毒等缺点有哪些,其亲水性聚氨酯树脂性和亲水性聚氨酯树脂促进会了免疫抗体性符合物在水相中的之间做用。同时,在肿瘤药物短时间检侧方向,体系结构TOCNF为掌握开关元件的锚定介面还没有经探讨。

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规划1. 特征提取调节器开关元件放置食物木质素上的THC探测软件系统提示图。特男人抗THC的截获抗原(anti-IC)的伯胺基使用 EDC/NHS TOCNF 的羧基之中造成酰胺键,造成才可以联系抗 THC + THC 免疫性混合物的生态学操作界面。

方案1展示了TOCNF上的抗体通过EDC/NHS化学结合及目标免疫复合物与捕获抗体结合的示意图。SPR的核心部件包括光学系统、传感器芯片、液体处理系统三个主要部分,基于SRP比较了生物界面偶联抗体与物理界面吸附抗体的检测性能。通过比较具有高电负性TOCNF和电中性纤维素的吸附能力,考察了表面电荷对分子相互作用的影响。此外,还打造了纸基比色法LFAs,纳米纤维素吸水后的膨胀提供了亲水间隔环境,有利于保持固定的捕获抗体的功能活性,有利于结合辣根过氧化物酶(HRP)标记的捕获抗体+THC复合体,减少了样本液体流动时检测抗体被消耗的风险。

2. 没想到与谈论

2.1. 捕捉到免疫抗体动物程序界面的准备及SPR中THC的在线检测

一开始核实了捉捕抗原在TOCNF上的非非特异聊天溶解。图1a表现了抗原溶解到TOCNF表面上能的SPR示意愿图,带负电的微米人造甲基纤维素表面上能对带正电的捉捕抗原(等电点6.5-9.5)有可观的溶解影响,溶解质量水平达1370 ng/cm2。并对照捕获抗体在不带电荷的纤维素表面上的吸附,在pH值为5时,阻止免疫抗体与TOCNF外层的大部分仰仗消除静电做用物理吸附,显示其吸附量高于EDC/NHS修饰的TOCNF(图1A和表1)。此外,研究了表面、THC、捕获抗体之间的非特异性相互作用,图1B显示无封闭试剂时,检测抗体在TOCNF上有较高非特异性吸附,图1C显示仅有THC存在时,与TOCNF表面没有表现出强相互作用,表1展示了非特定相互作用的吸附质量。

 

表 1 SPR中的猎取表面抗原固定的和非特男人联系。

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图 1. SPR 传感图:a) 在 pH 5 下,15 μg/mL 截获抗体阳性吸附到 TOCNF 和纤维素上,b) 15 μg/mL 捕捉免疫抗体吸附剂在 TOCNF 上,有(暗蓝色)和不存在(红颜色)BSA 封密, c) TOCNF 降解 1 μg/mL THC(无封密)。

此外,对于TOCNF表面物理吸附的抗体检测免疫复合物灵敏度的研究也十分重要。尽管TOCNF上吸附了大量的抗体(图2a和表1),但经过BSA封闭后不能有效结合免疫复合物(表2),并且免疫复合物在洗涤后很容易从物理吸附的表面去除,表明物理吸附的抗体以非活性构象附着,阻止了免疫复合物的正确结合。此外,与免疫复合物与TOCNF表面的相互作用比较,BSA封闭后TOCNF表面的相互作用具有相似的趋势(图2b)。

 

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图 2. SPR 调节器图:a)捕捉表面抗原吸到 TOCNF 上。b) 抗 THC + THC 免疫性黏结物与 15 μg/mL 抗 THC 和 1 μg/mL THC 吸在 BSA 加工后的 TOCNF(红白色)和 BSA 传导的 TOCNF(白色)上物理化学吸的捕捉到抗原表层上。c)将截获免疫抗体偶联到TOCNF上,EDC/NHS纯化,后来采集表面抗原和工业乙醇胺进行处理。d) BSA 进行处理后,TOCNF 上偶联的捕捉到免疫系统抗体接触面上气体吸附有 15 μg/mL antiTHC 和 2 或 10 μg/mL THC 的抗 THC + THC 免疫系统混合物,抗 THC (15 μg/mL) 结合起来到包涵 THC (0 μg/mL) 的偶联捕捉抗体阳性 生物学用户界面作基准。

此后,比较化学偶联抗体的结合效率发现,图2C显示出抗体在EDC/NHS激活后的TOCNF表面有较显著吸附。乙醇胺(pH 8.5)处理后SPR角减小,推测pH的变化影响了蛋白质的净电荷,静电相互作用的变化使抗体与界面结合松散。图2D显示了两种浓度的免疫复合物以及仅有捕获抗体存在时与生物界面的结合情况,与预期相同,在仅有检测抗体存在时固定捕获抗体的TOCNF表面上的结合率很低(表2),而THC存在时能够检测到免疫复合体的结合。值得注意的是,尽管THC疏水性较强,但在高度亲水的NC膜锚定表面与捕获抗体发生了相互作用,可能由于水分子的排出导致化学反应的熵增加,宏观上增加了捕获抗体-THC的结合亲和力。捕获抗体+THC免疫复合体结合不能随的捕获抗体量的增加而增加(图2和表2),高浓度(10μg/mLTHc)使捕获抗体+THc免疫复合物结合率增加约11%,低浓度(2μg/mLTHc)使结合率降低约25%。

表 2 猎取抵抗能力固定位置手段对 TOCNF 表面能免疫细胞分手后复合物配合的作用。

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2.2. 形貌变幻

进行AFM激光散斑技艺作品展示了固载抗体阳性、物理吸附牛血清廉球蛋白和天然免疫pp物对的表面体现碳奈米塑料膜形貌的影响力(图3)。

 

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图 3. SPR 感测器器上产品的样品的 AFM 图相和分布不均:a) 原使 TOCNF,b) TOCNF 离心分离的捕捉抗体阳性生物制品页面,c) 泄露于 BSA 和 THC + 抗 THCTOCNF 怪物画面,d) TOCNF 偶联驯服抵抗能力生物体菜单栏,各类 e) 曝光于 BSA 和免疫检测和好物后 TOCNF 上的偶联采集表面抗原怪物接面。、

2.3. THC在纸基的比色在线检测

同样以TOCNF为锚定层,采用EDC/NHS法将捕获抗体固定在测试区(T)上,二抗(抗小鼠免疫球蛋白)附着在对照区域(C)上。用HRP标记捕获抗体,在过氧化氢存在下与ABTS反应生成蓝绿色产物(图2),此外,3wt%的牛血清白蛋白和5wt%的酪蛋白水解物溶液作为封闭剂应用于底物上,采用THC阳性样和THC阴性样进行检测。图4显示了不同样品在测试区和控制区的示意图及相应的颜色,四氢大麻酚阴性样品检测后,仅在控制区出现绿色圆点(图4b),在对THC阳性样品进行测试后,在测试区和控制区都有着色,10-15 min得到比色结果(图4c)。为了突出锚定层和有效固定抗体的重要性,我们在物理吸附抗体的TOCNF上进行了类似的测试,其他系统底物没有着色。

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4.试从纸的THC检查测量:a)在试纸和比地区上提示规定的感知开关元件的关心图,b)在并没有THC(呈阴性范本)存在的的试从纸的比地区上的抗THC-HRP紧密联系关心图和Abts的比色形象,c)在试从纸与THC阳型范本来进行检查测量时免疫检查测量软型物紧密联系和比地区上的抗THC-HRP紧密联系的关心图,并且在试从纸用THC阳型范本来进行检查测量时在比地区上的抗THC-HRP紧密联系的关心图。

3. 报告

利用EDC/NHS化学偶联可以将抗体固定在TOCNF上,并用于SPR和纸基LFAs检测。SPR但是证实,EDC/NHS共价偶联抵抗能力到TOCNF上,可使抵抗能力粘紧地支承在外面并融入水相中免疫抗体抗原挽回物。虽说与共价融入不同于,电磁学活性炭吸附外面上的抓取抵抗能力更大,但其与免疫抗体抗原挽回物的融入率较共价融入更低。推测为TOCNF上捕获抗体的直接吸附导致其生物活性降低,或 TOCNF 的负电荷干扰了 THC 的捕获。此外,我们还展示了 EDC/NHS在纸基LFAs中的应用,可从水相中进行 THC 定量比色检测,NC膜与水相之间的相互作用,形成了提供高效传感信号的生物活性表面。
 
原句图片链接://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861722014229
原文出处:Solin K, Vuoriluoto M, Khakalo A, et al. Cannabis detection with solid sensors and paper-based immunoassays by conjugating antibodies to nanocellulose[J]. Carbohydrate polymers, 2023,

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